產品概述:產品內容
組分 | 6068S(20T) | T6068L(50T) |
A. BiotinTUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2 × 1.25 mL |
B. TdT酶 | 20 μL | 50 μL |
C. Streptavidin-HRP | 20 μL | 50 μL |
D. Streptavidin-HRP稀釋液 | 1 mL | 2×1.25 mL |
E. DAB顯色液A | 100 μL | 250 μL |
F. DAB顯色液B | 1 mL | 2×1.25 mL |
G. DAB顯色液C | 50 μL | 125 μL |
H. Proteinase K (2 mg/mL) | 40 μL | 100 μL |
I. DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
J. 10 × DNase I Buffer | 100 μL | 260 μL |
儲存條件本產品應置于 -20℃ 儲存,組分 A、E、G需避光,避免反復凍融。有效期見外包裝。注:組分 A、E、F、G 使用時請佩戴口罩、手套,接觸皮膚,請立即用大量水沖洗。 產品介紹細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解,這種降解非常特異并有規(guī)律,所產生的不同長度的 DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍,表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜,本試劑盒采用 TUNEL 法,應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal DeoxynucleotidylTransferase, TdT)在凋亡細胞斷裂 DNA 的 3′-OH 末端催化摻入生物素(Biotin)標記的 dUTP (Biotin-X-dUTP)。隨后和辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的 Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特異結合,最后在 HRP 的催化下通過DAB 顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡觀察并計數(shù)凋亡細胞。由于正常的或正在增值的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂,因而沒有 3′-OH 形成,很少能被染色。TUNEL 法可以選擇性的對凋亡細胞直接進行原位檢測,而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞,是一種更快速、直接的檢測手段。注意事項1. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。2. 疊氮化鈉對 HRP 有抑制作用,實驗中請勿使用含有疊氮化鈉的試劑。
說明書:UE-T6068S/T6068L MSDS:MSDS T6068 Biotin TUNEL Apoptosis Kit
常見問題解答:◆為什么出現(xiàn)了一些非特異標記?1. 有些細胞或組織,比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高,使得DNA全部被切斷,易導致假陽性。建議:取出細胞或組織后要立即固定并充分固定,以阻止這些酶的活性,同時設置陰性對照。2. 內源性過氧化物酶影響,建議:對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織,適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。3. 固定液濃度過高或過低,導致組織中心部分固定效果不佳,而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂,產生假陽性。建議:推薦使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏,細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間,并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結合,所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。6. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光,選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。◆為什么沒有染上熒光?1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛,現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇,乙醇固定液對組織的滲透力較弱,影響TUNEL標記效率.2. 細胞膜和核膜的通透不充分,TdT酶未能到達核內。細胞與冰凍切片,可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min,石蠟切片推薦使用蛋白酶K,37℃通透30 min;不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同,時間太長容易脫片,適當調整。3. 延長標記時間至2h,并適當增加TdT酶及dUTP的用量。4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照,驗證TdT酶反應是否正確進行。◆如何對細胞核進行復染?可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。◆為什么熒光背景高?1. 支原體污染:可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。2. TdT 酶反應時間過長,可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作,稀釋后的TdT酶僅供當日使用。3. 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細胞,有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA 斷裂。建議:在非高增殖期取樣檢測;4. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光,選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。5. DAB 孵育時間過長,減少DAB 染色時間。6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合,在TdT 酶反應之后,再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆標記率低?1. 乙醇、甲醇或甲醛(市面上購買的甲醛大多含有甲醇)固定的樣品標記效率較低(因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯(lián),而在操作中丟失),采用推薦的固定液。2. 固定時間過長,導致交聯(lián)程度過高,減少固定時間。3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡,會細胞皺縮,貼壁黏附力降低,導致凋亡細胞容易脫落。建議:在凋亡誘導結束后,可以對多孔板進行1000g離心5min,然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機,請注意操作輕緩,防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久?大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養(yǎng)時間根據(jù)組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。◆實驗的組織切片應該多厚?老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結腸厚度5–20 μm。
使用本產品的文獻:參考文獻1.Enhanced anti-tumor activity by the combination of TRAIL/Apo-2L and combretastatin A-4 against human colon cancer cells via induction of apoptosis in vitro and in vivo.應用方向:檢測結腸癌細胞的凋亡2.Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constitUEnts from Dysosma versipellis in PC3 and Bcap-37 cell lines.應用方向:檢測人前列腺癌細胞株PC3、乳腺癌細胞株Bcap-37、胃癌細胞株BGC-823的凋亡3.Caudatin-2,6-dideoxy-3-O-methy-β-D-cymaropyranoside 1 induced apoptosis through caspase 3-dependent pathway in human hepatoma cell line SMMC7721.應用方向:檢測人肝癌細胞系SMMC7721的凋亡4.Chemical constitUEnts of the ethyl acetate extract of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities.應用方向:檢測PC3、MGC-803、Bcap-37和MCF-7細胞系的凋亡5.Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety.應用方向:檢測胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞Bcap-37的凋亡